自剪接內含子（核酶）是具有催化活性的RNA，主要參與RNA的加工與成熟。與蛋白酶類(lèi)似，核酶也會(huì )折疊成高級結構發(fā)揮功能。RNA在一級序列的基礎上形成局部的helix、loop等二級結構元件，再在金屬離子的幫助下進(jìn)一步折疊成具有酶活中心的三級結構，在無(wú)需蛋白質(zhì)的情況下催化反應。但由于RNA的異質(zhì)性和靈活性，使RNA結構的解析受到了很大的挑戰，限制了人們對其結構和功能間聯(lián)系的理解。
在許多生物體中，I型核酶通過(guò)兩個(gè)連續的酯交換反應催化自身從RNA前體中切除。嗜熱四膜蟲(chóng)I型核酶是第一個(gè)被發(fā)現的核酶，自20世紀80年代被發(fā)現以來(lái)，大量的生物化學(xué)和遺傳學(xué)研究已經(jīng)闡明了四膜蟲(chóng)核酶的潛在催化機制，但獲得其全長(cháng)分子的三維（3D）結構以及其催化功能所需的3D結構中的詳細重排一直是重大的科學(xué)挑戰。張凱銘等團隊此前首次解析了四膜蟲(chóng)核酶的全長(cháng)結構（Nature 2021），并解析了多個(gè)不同構象錯誤折疊的四膜蟲(chóng)核酶結構（PNAS 2022），為冷凍電鏡解析高分辨率RNA結構做出了表率。
為了解析四膜蟲(chóng)核酶催化的結構基礎以及伴隨兩步自剪接反應的構象變化，張凱銘課題組分別進(jìn)行了第一步和第二步剪接反應底物的設計，并通過(guò)冷凍電鏡解析了四膜蟲(chóng)核酶第一步剪接過(guò)程中的四種構象（Nucleic Acids Research 2023）和第二步剪接過(guò)程中的六種構象（Nature Communications 2023），深入剖析了四膜蟲(chóng)核酶的剪接機制。
研究人員首先在體外驗證了設計后的底物可以完成催化反應，并確定了核酶與底物的最優(yōu)反應條件，然后利用單顆粒冷凍電鏡在解析高異質(zhì)性或靈活性的樣品方面的獨特優(yōu)勢，捕獲了四膜蟲(chóng)核酶自剪接過(guò)程中的多種不同構象（圖1）。
圖1.冷凍電鏡解析四膜蟲(chóng)核酶兩步自剪接過(guò)程中的多種不同構象。
通過(guò)結構比對，在四膜蟲(chóng)核酶的第一步剪接反應過(guò)程中，核酶5′端的IGS/IGSext與5′剪接底物配對形成P1/P1ext雙鏈（pre-dock-1S），其會(huì )圍繞J1/2發(fā)生~50 ?的移動(dòng)將底物帶至核酶催化活性中心（pre-1S）。P1和催化活性中心內的三個(gè)單鏈片段(J8/7、J4/5、J5/4)之間的三級相互作用介導了P1/P1ext雙鏈的正確定位。隨后，早已占據活性位點(diǎn)的外源GTP的3′-OH對5′剪接位點(diǎn)進(jìn)行親核攻擊，完成第一步轉酯反應（post-1S）。在第二步剪接反應過(guò)程中，3'剪接底物取代外源GTP，P7ext形成并引導3' -剪接底物結合，形成部分P10雙鏈 (intermediate pre-2S)。隨后完整P10雙鏈的形成使3'剪接位點(diǎn)靠近酶活位點(diǎn)，為第二次酯交換反應做好準備（pre-2S）。完成第二步轉酯反應后（post-2S），P1/P10雙鏈離開(kāi)活性位點(diǎn)，圍繞J1/2發(fā)生~50 ?的移動(dòng)將連接產(chǎn)物帶至無(wú)底物位點(diǎn)（pre-release 2S），然后經(jīng)歷解旋過(guò)程釋放產(chǎn)物（releasing states）。概況來(lái)說(shuō)，在四膜蟲(chóng)核酶的自剪接過(guò)程中，核酶發(fā)揮功能的同時(shí)伴隨著(zhù)構象的顯著(zhù)改變，這種變化主要集中在核酶5′端的IGS/IGSext（圖2）。此外，研究人員發(fā)現除構象改變外，活性位點(diǎn)的金屬離子和一些氫鍵也會(huì )發(fā)生細微重排，以促進(jìn)催化和協(xié)調自剪接反應。
圖2．自剪接過(guò)程中四膜蟲(chóng)核酶構象變化的示意圖。P表示堿基配對區域。
這些研究結果使得核酶的功能在原子水平上得到了更好的剖析，并突出了冷凍電鏡捕獲動(dòng)態(tài)RNA結構改變的能力。隨著(zhù)冷凍電鏡在結構異質(zhì)性分子中應用的不斷推進(jìn)，研究人員預計它將成為探索越來(lái)越多生物學(xué)上有趣的研究課題的關(guān)鍵工具，比如RNA系統的折疊和組裝。
中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫學(xué)部的博士研究生張曉靜和李珊珊副研究員為（Nucleic Acids Research 2023）的共同第一作者，李珊珊副研究員為（Nature Communications 2023）的第一作者，張凱銘教授和李珊珊副研究員為兩篇文章的共同通訊作者。這兩項工作中冷凍樣品初篩、數據收集與處理在中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)冷凍電鏡中心完成，該工作也獲得了細胞動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室的大力支持。研究工作的開(kāi)展得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計劃、中科大科研啟動(dòng)經(jīng)費和中科院率先行動(dòng)引才計劃擇優(yōu)經(jīng)費的資助。
原文鏈接:
https://academic.oup.com/nar/article/51/3/1317/6993854
https://www.nature.com/articles/s41467-023-36724-5
（生命科學(xué)與醫學(xué)部、科研部）
